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詳解WB實驗到底需不需要內參抗體

2020-06-15 [3662]

WB實驗是檢測一個基因的表達產物是否正確,或者比較表達產物量的相對變化。Western Blot在有些人眼里做起來很簡單,可實驗不順的時候經常會出現做不出結果、假陽性啦、結果出現多條帶等情況。

這到底是一抗有問題還是二抗有問題?所以,嚴謹的Western Blot實驗設計中要求有良好的參照體系,對實驗結果分析是非常有用的。

內參即是內部參照,對于哺乳動物細胞表達來說一般是指由管家基因編碼表達的蛋白,它們在各組織和細胞中的表達相對恒定,在檢測蛋白的表達水平變化時常用它來做參照物。

在WB中使用內參其實就是在WB過程中的另外用內參對應的抗體檢測內參,這樣在檢測目的產物的同時可以檢測內參的表達,由于內參在各組織和細胞中的表達相對恒定,借助檢測每個樣品內參的量就可以用于校正上樣誤差,這樣半定量的結果才更為可信。

此外使用內參可以作為空白對照,檢測蛋白轉膜情況是否*、整個WB顯色或者發光體系是否正常。

實驗結果分析其實很簡單:如果樣品蛋白量有限,只夠進行一次電泳轉膜實驗時,分別檢測樣品的內參量和目的蛋白量。

將各樣品目的蛋白量分別除以其內參含量,得到的數值即為內參校正后的各樣品中目的蛋白相對含量,再用此數值進行樣品間的比較和分析,得到目的蛋白含量在不同樣品間的實際變化結果。如果樣品量充分,可以先檢測內參,觀測樣品間內參顯色條帶是否一致,根據差異大小調整各樣品的上樣量重新進行Western Blotting實驗,至內參量一致為止;若內參一致,即可進行不同樣品間目的蛋白表達變化分析。這樣雖然麻煩一點,但是可以保證結果更有說服力,更可信。畢竟我們的實驗是一種嚴謹的工作。

常用的細胞總蛋白質內參有GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)和細胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin,這其中近的國外文獻報道中使用GAPDH內參的較多。

對于一些植物的樣本,則需要特別的植物Actin蛋白作為內參;同樣的,如果提取的樣本是細胞核蛋白,那么PCNA或者組蛋白H3都是被經常使用的;而針對一些研究線粒體的客戶,那么Cox IV則被較多的文獻引用作為線粒體總蛋白的內部參考。

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