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大鼠2,3-二磷酸甘油酸(2,3-DPG)ELISA KIT的操作步驟

2022-05-30 [1337]

大鼠2,3-二磷酸甘油酸(2,3-DPG)ELISA KIT背景:

大鼠2,3-二磷酸甘油酸(2,3-DPG)ELISA KIT用于測定人血清,血漿及相關(guān)液體樣本中2,3-二磷酸甘油酸(2,3-DPG)的含量。


實(shí)驗(yàn)原理:

試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標(biāo)本中人2,3-二磷酸甘油酸(2,3-DPG)水平。用純化的人2,3-二磷酸甘油酸(2,3-DPG)抗體包被微孔板,制成固相抗體,往包被單抗的微孔中依次加入2,3-二磷酸甘油酸(2,3-DPG),再與HRP標(biāo)記的2,3-二磷酸甘油酸(2,3-DPG)抗體結(jié)合,形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物,經(jīng)過*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的。顏色的深淺和樣品中的2,3-二磷酸甘油酸(2,3-DPG)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度(OD值),通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中人2,3-二磷酸甘油酸(2,3-DPG)濃度。


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操作步驟

1.標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣:在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔10孔,在、第二孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品100μl,然后在、第二孔中加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl,混勻;然后從孔、第二孔中各取100μl分別加到第三孔和第四孔,再在第三、第四孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl,混勻;然后在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉,再各取50μl分別加到第五、第六孔中,再在第五、第六孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50ul,混勻;混勻后從第五、第六孔中各取50μl分別加到第七、第八孔中,再在第七、第八孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl,混勻后從第七、第八孔中分別取50μl加到第九、第十孔中,再在第九第十孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl,混勻后從第九第十孔中各取50μl棄掉。(稀釋后各孔加樣量都為50μl,濃度分別為2400nmol/L,1600nmol/L,800nmol/L,400nmol/L,200nmol/L。

2.加樣:分別設(shè)空白孔(空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑,其余各步操作相同)、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl,然后再加待測樣品10μl(樣品終稀釋度為5倍)。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動(dòng)混勻。

3.溫育:

用封板膜封板后置37℃溫育3 0分鐘。


4.配液:

將30(48T的20倍)倍濃縮洗滌液用蒸餾水30(48T的20倍)倍稀釋后備用。


5.洗滌:

小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30秒后棄去,如此重復(fù)5次,拍干。


6.加酶:

每孔加入酶標(biāo)試劑50μl,空白孔除外。


7.溫育:

操作同3。


8.洗滌:

操作同5。

9.顯色:每孔先加入顯色劑A50μl,再加入顯色劑B50μl,輕輕震蕩混勻,37℃避光顯色15分鐘.

10.終止:

每孔加終止液50μl,終止反應(yīng)(此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn))。


11.測定:

以空白空調(diào)零,450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。



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