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犬B細胞淋巴瘤因子試劑盒

2015-09-15 [1236]

犬B細胞淋巴瘤因子試劑盒
該試劑盒以 HRP標記的鏈霉親和素復合物(HRP Streptavidin Conjugate,HRP-SA)為基礎,可用于檢測細胞、組織B細胞淋巴瘤因子2(Bcl-2)、特異性強、定性定位    、背景清晰。在所用的B細胞淋巴瘤因子2(Bcl-2)一抗與相應靶抗原抗原。該試劑盒,用生物化二抗與一抗特異性,zui后加 HRP-SA,形成抗原—特異一抗—生物素化二抗—HRP-SA復合物,顯微鏡下觀察成像。 
試劑盒所含試劑:
試劑A 通透液:0.1% Triton-X 100   10 mL(選用) 
試劑B 2瓶封閉
試劑C (*分裝)已稀釋的即用型bcl-2一抗(2.5ml) 
試劑D (*分裝)生物素化       IgG 1支 
(濃度1.5 mg/mL,稀釋     1:300~1:500)50 μL+抗體稀釋液20ml 
(封閉用) 10ml/瓶 
試劑E  HRP-SA復合物1支(濃度1 μM,稀釋     1:50~1:200)100 μL 
試劑F  DAB顯色液 5ml 
用戶自備試劑:
1. 10mM TBS(pH7.2~7.4) 
犬B細胞淋巴瘤因子試劑盒

加蒸餾  800mL,濃鹽酸調pH值至7.2~7.4,zui后定容至1000mL TBS-T:TBS+Tween 20(0.05%體積) 
2.抗原修復液(依檢測抗原不同而選擇不同的修復液) 
10mM pH6.0 檸檬酸
檸檬酸0.38g 
檸檬酸三鈉2.45g 
加蒸餾  900mL,濃鹽酸調pH值至6.0,zui后定容至1000mL 
或:0.5M EDTA修復液(pH8.0) 
EDTA·2H2O 186.1g 
檸檬酸三鈉2.45g 
加蒸餾  700mL,用10mM NaOH調pH值至8.0,zui后定容至1000Ml . 
10 mL 
4. Tween 20 5 mL 
石蠟包埋組織切片
實驗步驟(建議方案):
石蠟包埋組織切片3~4μm 厚度 
1.烤片: 將待做切片,于60℃恒溫烤箱中至少烤1 hr; 3次(即二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ),每次
2.脫蠟: 切片放10 min; 
3.    : 切片經下行酒精    ,無乙醇2 min;75%乙醇2min,自來5min,95%乙醇2次(每次2min),85%,ddH2O洗2×2min; 
4.抗原修復: 根據抗體說明書推薦方法進行抗原修復,常采用高壓、微波(溫度達到98~100℃)或酶消化修復法,室溫自然    ,自來2min,TBS洗滌(2×2min)(5步封閉。 
5.封閉: 滴加試劑B,37℃濕盒孵育30 min; ,ddH2O洗2×1)* 注:有些抗原勿需修復,
直接進
6.加一抗:滴加用試劑C(即用型一抗),37℃濕盒孵育2 hr 或4℃夜; 
7.洗滌: TBS-T洗滌(3×5 min); 
8.封閉: 滴加試劑B,37℃濕盒孵育10 min; 
9.加二抗: 滴加用抗體稀釋液稀釋的生物素化二抗(試劑D),37℃濕盒中孵育30 min; 
10.洗滌: TBS-T洗滌(3×5 min); 
11.封閉: 滴加試劑Tween 20,37℃濕盒孵育封閉20 min; 
12.加HRP-SA: 滴加用試劑C稀釋的試劑E(1:50~200,終濃度5~20 nM),37℃濕盒中孵育30 min; 
13.洗滌: TBS-T洗滌(3×5 min),TBS洗滌(2×5 min); 
14.顯色:應用DAB溶液(試劑F)顯色; 
15.復染:自來,復染,脫  ,透明; 
16.封片: 待組織標本干后,用試劑
17.觀察成像: 顯微鏡下觀察成像。 封片; 

注意事項:犬B細胞淋巴瘤因子試劑盒
1. 修復后,自來,驟。 

2. ,用過的檸檬酸用。 
3. 若試劑為微量濃    ,用前應低速離心,將。
4. 封片前一定要換用TBS ,以便洗去組織上殘留的Tween 20,否則會影響。 
5. 如須復染細胞核,則在封片前復染或直接采用含有染核試劑的封片劑進行封片。 
附1:
抗原修復方法
常用抗原修復液:檸檬酸9.0)等等。 (0.01M pH6.0)、EDTA 抗原修復液(pH8.0 或,在組織上滴加胃蛋白酶或胰蛋白酶,37℃孵育。 ,將脫蠟
一、酶消化修復法切片脫蠟,TBS20~30min后TBS
二、微波抗原修復法
微波盒中加切片架上,放,中檔或10~15min,取出微波盒,自來,取出切片。因不同微波爐微波處理時間存在差異,須自行調整。 
三、直接高壓抗原修復法
取修復液于不銹鋼高壓鍋中加熱至    ,將組織切片,修復液然,蓋上鍋蓋,待噴1.5~2.5min即可脫離熱源,自,取出切片。此方法適用于較難檢測或核抗原的修復。
四、隔不銹鋼高壓鍋中加自來騰,將切片放,微波盒中加,待噴4~8 min即可,自然,取出切片。此方法適用于較難檢測或核抗原的修復。 


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